Гиз был одним из инициаторов Варфоломеевской ночи и, чтобы отомстить за своего отца, принял на себя убийство Колиньи. (За несколько дней до Варфоломеевской ночи на адмирала Колиньи было совершено покушение, но он был только ранен, а тот, кто нанес ему рану, спрятался в доме Гиза и его «никак не могли сыскать» для должного наказания.)
В ночь святого Варфоломея около 11 часов вечера по распоряжению Генриха Гиза в Лувре были блокированы король Генрих Наваррский и принц Конде. Все дома, где в Париже располагались гугеноты, были помечены знаками. В зале городской ратуши собрались вооруженные католики, и перед ними выступил с проникновенной речью за истинную веру Христову сам герцог Гиз, призывая покончить с гугенотами. Затем Генрих Гиз и его приближенные отправились к дому Колиньи. В то же время удар колокола церкви Святого Германа известил о начале расправы над гугенотами. Подойдя к дому адмирала, Генрих Гиз потребовал, чтобы ему и его отряду открыли дверь. Ворвавшись в дом, капитан Аттен, Бем, Сарлабу и солдаты нанесли адмиралу Колиньи множественные раны, от которых тот скончался. По приказу Гиза его труп был выброшен из окна, а утром отвезен на живодерню и повешен на цепях головой вниз, где провисел еще несколько дней. Так Генрих отомстил за смерть своего отца.
Когда по восшествии на престол Генриха III протестантам были сделаны некоторые уступки, Гиз в 1576 году выступил ярым защитником «истинной веры». Прикрываясь преданностью католической вере, Генрих Гиз строил далеко идущие планы – овладение французской короной. Именно к этому времени относится составленное для Гизов генеалогическое древо, где их род возводился практически к Карлу Великому и не уступал по знатности происхождения королевскому. По всей стране Гиз вербует своих союзников, создавая тайные общества защитников католицизма. Центром обществ, опутавших всю Францию, был Париж, в котором находился центральный комитет организации, получившей название Священной лиги. Генрих Гиз рассчитывал, что при помощи Лиги ему будет легче прийти к власти. Гизов поддерживал и римский папа, с которым велась постоянная переписка. Один из курьеров Гиза скончался по пути в Рим, и при нем были обнаружены письма для папы, из которых король Генрих III и узнал о существовании Лиги. Понимая, какую опасность представляла Лига для него лично, он сам вступил в нее и именным указом одобрил ее существование и встал во главе Священной лиги. После этого для Гиза Лига потеряла всякий смысл, и он великодушно предоставил королю заниматься борьбой с гугенотами, а сам занялся созданием нового союза. Затем началась новая междоусобная война, закончившаяся в 1580 году неблагоприятным для протестантов Перигорским миром.
